產(chǎn)品概述：

儲存條件

20℃保存，有效期見外包裝

產(chǎn)品內(nèi)容

規(guī)格 組分	T6068S（20 T）	T6068L（50 T）
A. Biotin TUNEL Reaction Buffer	1 mL	2 × 1.25 mL
B. TdT Enzyme	40 μL	100 μL
C. Streptavidin-HRP	20 μL	50 μL
D. Streptavidin-HRP稀釋液	1 mL	2 × 1.25 mL
E. DAB濃縮液（20×）	50 μL	125 μL
F. DAB稀釋液	1 mL	2 × 1.25 mL
G.顯色增強(qiáng)劑（10×）	100 μL	250 μL
H. Proteinase K（2 mg/mL）	40 μL	100 μL
I. DNase I（2 U/μL）	5 μL	13 μL
J. 10× DNase I Buffer	100 μL	260 μL

注：（1）組分A、C、E、F需避光保存。（2）組分B、C、H、I請注意冰上操作。（3）組分F避免反復(fù)凍融，建議分裝保存。（4）使用前請將產(chǎn)品瞬時(shí)離心至管底，再進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

產(chǎn)品介紹

細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，一些DNA內(nèi)切酶被激活，這些內(nèi)切酶會切斷核小體間的基因組DNA，產(chǎn)生180 bp-200 bp的DNA 片段，斷裂的DNA片段暴露出大量的粘性3'-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的催化作用下，與生物素（Biotin）-dUTP結(jié)合，隨后和辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的Streptavidin（Streptavidin-HRP）結(jié)合，最后在HRP的催化下通過DAB顯色來顯示凋亡細(xì)胞，從而通過光學(xué)顯微鏡直接進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（Terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling, TUNEL）。

本試劑盒應(yīng)用范圍廣，可用于檢測冷凍或石蠟切片中的細(xì)胞凋亡情況，也可檢測培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞或懸浮細(xì)胞的凋亡情況。可選擇性的檢測凋亡細(xì)胞，而非壞死細(xì)胞或因輻照和藥物治療而造成的DNA鏈斷裂的細(xì)胞。

注意事項(xiàng)

1．使用前請將產(chǎn)品瞬時(shí)離心至管底，再進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2．疊氮化鈉對HRP有抑制作用，實(shí)驗(yàn)中請勿使用含有疊氮化鈉的試劑。

3．本產(chǎn)品僅限于科研，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品和藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。

4．為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

說明書：

 T6068S/T6068L    

常見問題解答：

◆為什么出現(xiàn)了一些非特異標(biāo)記？

1. 有些細(xì)胞或組織，比如平滑肌核酸酶或聚合酶活性水平較高，使得DNA全部被切斷，易導(dǎo)致假陽性。建議：取出細(xì)胞或組織后要立即固定并充分固定，以阻止這些酶的活性，同時(shí)設(shè)置陰性對照。
2. 內(nèi)源性過氧化物酶影響，建議：對于肝臟、腎臟等血細(xì)胞含量多的組織，適當(dāng)延長封閉時(shí)間和升高過氧化氫的濃度。
3. 固定液濃度過高或過低，導(dǎo)致組織中心部分固定效果不佳，而使得中心部細(xì)胞自溶、DNA鏈出現(xiàn)不規(guī)則斷裂，產(chǎn)生假陽性。建議：推薦使用4%多聚甲醛。
4. TdT 酶反應(yīng)時(shí)間過長或Tunel反應(yīng)過程中反應(yīng)液發(fā)生蒸發(fā)或滲漏，細(xì)胞或組織表面不能保持濕潤。注意控制反應(yīng)時(shí)間，并確保TdT 酶反應(yīng)液能很好地覆蓋樣品。
5. 石蠟、脂肪、血液、體液等都較易與染料結(jié)合，所以組織切片制作時(shí)要保持干凈、脫蠟要徹底。
6. 有些試劑或細(xì)胞存在自發(fā)熒光，選擇染料時(shí)要避開自發(fā)熒光的顏色。

◆為什么沒有染上熒光？
1. 固定不充分。固定液首選4%多聚甲醛，現(xiàn)用現(xiàn)配。不建議使用乙醇，乙醇固定液對組織的滲透力較弱，影響TUNEL標(biāo)記效率.
2. 細(xì)胞膜和核膜的通透不充分，TdT酶未能到達(dá)核內(nèi)。細(xì)胞與冰凍切片，可用0.2% Triton X-100溶液通透5-30min，石蠟切片推薦使用蛋白酶K，37℃通透30 min；不同的細(xì)胞和組織所需要的通透時(shí)間略有不同，時(shí)間太長容易脫片，適當(dāng)調(diào)整。
3. 延長標(biāo)記時(shí)間至2h，并適當(dāng)增加TdT酶及dUTP的用量。
4. 確定實(shí)驗(yàn)對象細(xì)胞有凋亡。準(zhǔn)備一份DNase I處理的陽性對照，驗(yàn)證TdT酶反應(yīng)是否正確進(jìn)行。

◆如何對細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染？
可在TUNEL反應(yīng)結(jié)束后對細(xì)胞核進(jìn)行染色。

◆為什么熒光背景高？
1. 支原體污染：可以使用支原體染色檢測試劑盒驗(yàn)證。
2. TdT 酶反應(yīng)時(shí)間過長，可以用試劑盒提供的TdT酶稀釋液將TdT酶稀釋2-5倍后再按照說明書操作，稀釋后的TdT酶僅供當(dāng)日使用。
3. 處于高速分裂和增殖狀態(tài)中的細(xì)胞，有時(shí)也會出現(xiàn)細(xì)胞核中的DNA 斷裂。建議：在非高增殖期取樣檢測；
4. 有些試劑或細(xì)胞存在自發(fā)熒光，選擇染料時(shí)要避開自發(fā)熒光的顏色。
5. DAB 孵育時(shí)間過長，減少DAB 染色時(shí)間。
6. Biotin-X-dUTP 的非特異性結(jié)合，在TdT 酶反應(yīng)之后，再用含0.1% Triton X-100 和1 mg/ml BSA 的PBS 洗三次。

◆標(biāo)記率低？
1. 乙醇、甲醇或甲醛（市面上購買的甲醛大多含有甲醇）固定的樣品標(biāo)記效率較低（因?yàn)樵诠潭〞r(shí)染色質(zhì)未能與蛋白質(zhì)交聯(lián)，而在操作中丟失），采用推薦的固定液。
2. 固定時(shí)間過長，導(dǎo)致交聯(lián)程度過高，減少固定時(shí)間。
3. 貼壁細(xì)胞如果使用藥物誘導(dǎo)凋亡，會細(xì)胞皺縮，貼壁黏附力降低，導(dǎo)致凋亡細(xì)胞容易脫落。建議：在凋亡誘導(dǎo)結(jié)束后，可以對多孔板進(jìn)行1000g離心5min，然后再吸出培養(yǎng)基并用PBS洗滌。如果沒有適合的離心機(jī)，請注意操作輕緩，防止發(fā)生凋亡的細(xì)胞在洗滌時(shí)被洗去。后續(xù)整個(gè)操作也需要輕緩。

◆在蛋白酶K中消化組織樣品多久？
大部分組織樣品需要充分消化15分鐘。最佳的培養(yǎng)時(shí)間根據(jù)組織類型和厚度而不同。腦組織比其他組織需要更長的蛋白酶處理時(shí)間。 

◆實(shí)驗(yàn)的組織切片應(yīng)該多厚？
老鼠腸、腎臟、肝臟、心臟和結(jié)腸厚度5–20 μm。

使用本產(chǎn)品的文獻(xiàn)：

參考文獻(xiàn)
1.Enhanced anti-tumor activity by the combination of TRAIL/Apo-2L and combretastatin A-4 against human colon cancer cells via induction of apoptosis in vitro and in vivo.
應(yīng)用方向：檢測結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡

2.Antiproliferation and cell apoptosis inducing bioactivities of constitUEnts from Dysosma versipellis in PC3 and Bcap-37 cell lines.
應(yīng)用方向：檢測人前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3、乳腺癌細(xì)胞株Bcap-37、胃癌細(xì)胞株BGC-823的凋亡

3.Caudatin-2,6-dideoxy-3-O-methy-β-D-cymaropyranoside 1 induced apoptosis through caspase 3-dependent pathway in human hepatoma cell line SMMC7721.
應(yīng)用方向：檢測人肝癌細(xì)胞系SMMC7721的凋亡

4.Chemical constitUEnts of the ethyl acetate extract of Belamcanda chinensis (L.) DC roots and their antitumor activities.
應(yīng)用方向：檢測PC3、MGC-803、Bcap-37和MCF-7細(xì)胞系的凋亡

5.Synthesis and cytotoxicity of novel ursolic acid derivatives containing an acyl piperazine moiety.
應(yīng)用方向：檢測胃癌細(xì)胞MGC-803和乳腺癌細(xì)胞Bcap-37的凋亡